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组织细胞内成分的流式检测
发布人:viking2000    看下 2126 次    时间:2012年8月9日    

一、一般原理

  组织细胞成分是可溶性小份子热量或者多肽,在淋巴组织细胞答复中有首要的免疫力改善作用。一开始组织细胞成分表达与T组织细胞功效有关性研究是利用特定克隆组织细胞的激活,只要激活的组织细胞亚群可以表达组织细胞成分,运动的畸形淋巴组织细胞(T、B、NK)不能排泄组织细胞成分。

  胞内流式组织细胞术的提高是利用Jung与Picker采用monensin,PMA,BFA和Monensin等药品预孵检测胞内组织细胞成分的表达的方法。这一方法影响T组织细胞活化,阻断了胞内高尔基体介导的传达引发组织细胞成分堆积,积储,提高组织细胞成分数据可被流式组织细胞仪检测。

  胞内流式组织细胞术具有添上方法没能比较的优势:高效,轻便,活络度高,高效,安全放心,接近病毒体的总结情况。

二、研究型材

(1)研究设备
1)流式上样管及组织细胞培养皿或板
2)25%CO2,37℃孵箱
3)混匀共鸣器
4)离心计
5)移液器、Tips
6)流式组织细胞仪

(2)需要的触媒
1)荧鼠标准的组织细胞表面上份子及胞内成分的单抗触媒
(Biolegend公司赋予品种充分的不同荧鼠标准的痘苗,细节可以直接在达科为网站查找,或者登入biolegend的网站www.biolegend.com)
2)红组织细胞裂化液RCL buffer(Biolegend Cat. #420301)
3)激活剂
遵照检测目标和饮食的不同,需要选择不同的影响剂和影响时间,最常用为Ionomycin,PMA和PHA。
4)阻断剂:
Brefeldin-A (Biolegend 1000x Cat. #420601, 使用前浓缩到1X)
或者 Monensin (Biolegend 1000x Cat. #420701,使用前浓缩到1X)
Brefeldin-A为Goligiplug,能影响高尔基体的引起,抑制组织细胞成分的分泌。一般检测TNF-α,IL-6,Il-12.MCP-1的效果较好。
Monensin 为Goligistop,抑制组织细胞成分驾驶经过膜。一般检测IL_3,IL-4,IL-5,IL-1,Il-13效果较好。
5)稳定剂Fixation buffer( Biolegend Cat. #420801)
含4%的多聚阿尼林PBS溶胶,室温留存。
6)破膜剂Permeabilization buffer( Biolegend Cat. #421001)
含1%皂甙, 4℃存放。
7)Cell staining buffer
重要为FBA或者BSA,两者差异不大,一般是FBA,特别情况可挑选BSA。

三、常用的饮食类型和处理方法

1、全血
  使用肝素钠抗凝,不容易采用肝素锂,EDTA和ACD抗凝剂,血样在8小时内总结。如不能在8小时以内检测,应将真空采腔道水平室温存放。

2、外周血各自核组织细胞或者组织细胞系与T组织细胞克隆
  改善组织细胞浓度2×106组织细胞/mL于含10%FBS 的PMI-1640培养基中。

四、相对

  准确的系统相对可以减小正确度。当试验想不到准确时,可以遗忘激活相对与胞内蜡染相对,但是每次研究都需要做未影响与同型相对。

1、 未影响相对
作品不加影响剂,出于安全放心考虑最好还是用在评价体外激活进程中生成的组织细胞成分水平。

2、 同型相对
  与一抗同样来源,同样亚型或亚链,同样荧鼠标准的痘苗,出于安全放心考虑最好还是用在检测组织细胞与痘苗非特异结合所至非特异蜡染。

3、 激活相对
  如用CD69组织细胞表面上蜡染,如果未到达CD69希望的水平,则激活序列出了问题,某一触媒容易失活,过期,制备不当或触媒感染。

4、 胞内蜡染相对
  如用胞内CD69蜡染与激活相对想不到比较来评价通透与胞内蜡染是不是准确进行。如果激活相对阳性率只要90%而胞内CD69未到达相应水平,则通透与胞内蜡染容易序列出了问题。

五、研究序列
(以Biolegend产品检测全血版次的胞内成分来说)
1.往影响处理的全血中,每管加入1-2mL 1Xred blood cell lysis buffer(使用前,先从冰箱里面取出,用无菌水浓缩,恢复到室温),共鸣混匀,RT(室温), 避光孵育5~10min。
2.离心,350g,5min,弃上清。
3.每管加入1-2 mL Cell staining buffer洗濯组织细胞,350g,5min 离心。
4.分别加入0.25ug表面上标准份子痘苗, RT,避光孵育15-20min
5.每管加入0.25-0.5mL fixation buffer, RT,避光孵育20min。
6.离心,350g,5min,弃上清
7.每管加入1-2 mL 1Xpermeabilization wash buffer,350g,5-10min,弃上清。
8.反复序列7洗濯组织细胞双向
9.加入100uL permeabilization wash buffer重悬组织细胞,分别加入对应的0.25-0.5ug胞内成分痘苗,RT 避光孵育20min。
10.每管加入1-2ml的1X Permeabilization wash buffer 洗濯组织细胞双向,350g,5min.
11.每管加入0.5ml Cell staining buffer重悬,上机检测。

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