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构造细胞表面上痘苗的流式检测
发布人:viking2000    看下 2597 次    时间:2012年8月9日    

A.扁桃体构造构造细胞或培养构造细胞表面上痘苗流式检测序列

(一)构造细胞作品预备
收集构造或构造细胞
1. 取出目的构造(如:扁桃体、扁桃体结、胸腺、扁骨等),高效浸泡在Cell Staining Buffer (BioLegend Cat. #420201)中,并利用鐾及过滤等方法制备成单构造细胞悬液;如果为体外培养构造细胞,间接用Cell Staining Buffer重悬构造细胞后进行下一步操作执行。
2. 增加Cell Staining Buffer至约15mL,离心(350 x g)5分钟后弃去上清液。

裂化红构造细胞(扁桃体构造等)
3. 如作品为扁桃体构造构造细胞,需要裂化红构造细胞。把10X 红构造细胞裂化液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301) 用去标记原子水浓缩成1X工作液。然后用3 ml红构造细胞裂化工作液重悬构造细胞后,在冰上孵育5分钟。
4. 加入10 ml Cell Staining Buffer到管中;离心(350 x g)5分钟后弃去上清液。
5. 反复洗濯构造细胞一次(序列2)。
6. 用Cell Staining Buffer重悬构造细胞后计数,浓缩构造细胞为5-10 x 106构造细胞/ml,然后每支流式检测管中加入100uL构造细胞悬液(5-10 x 105 构造细胞/管)。

Fc受体开放(可选)
7. Fc受体的开放序列是就是为了避免痘苗的非特异性结合带来的影响;对于小鼠构造细胞的检测,BioLegend公司的纯化抗小鼠 CD16/CD32 痘苗特异上看并结合Fcγ R III/II (Cat. #101302, clone 93),适用于开放痘苗非特异蜡染;研究操作执行为用5-10 μg/ml纯化CD16/32痘苗与构造细胞冰上孵育10分钟。而对于市面上没有可用的人或大鼠开放痘苗,可以采用加入无关纯化免疫力球蛋白(如与所用激光标准痘苗同样种属和痘苗亚型)到构造细胞作品中进行开放。

(二)构造细胞表面上激光蜡染序列
8. 在大多数流式检测管中加入足够的预浓缩OK一抗(激光标准痘苗、病毒标准痘苗或纯化痘苗);在空洞管/孔或同型相对管/孔中加入与痘苗同样量的相对触媒。然后各管避光冰浴或在4℃冰箱中孵育15-20分钟。(注:有些痘苗容易需要更长的孵育时间,建议研究者进行预试验探讨)
9. 加入至多2mL Cell Staining Buffer,然后350g离心5分钟后弃去上清液;反复洗濯序列双向。
10.(间接标准)若使用的一抗是纯化或病毒素标准痘苗,则每管/孔加入足够浓缩OK激光标准二抗或激光标准亲和素(SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204)后于冰浴或在4℃冰箱中避光孵育15-20分钟。
11. 反复洗濯构造细胞一次(按序列9)。
12. 用0.5 ml Cell Staining Buffer 重悬构造细胞;若有必要,加入10uL(0.25 μg)/million构造细胞的核辰砂7-AAD(BioLegend Cat. #420401)以发现活、死构造细胞,冰上孵育3-5分钟。(注:我们不建议7-AAD与PE-Cy5 或 PE-Cy7等激光标准痘苗联用)13.上机检测并总结想不到。

B.全血构造细胞表面上痘苗的流式检测序列

1.往含有100uL抗凝全血的流式检测管中加入足够的预浓缩OK一抗(激光标准痘苗、病毒标准痘苗或纯化痘苗)。
2. 室温避光孵育15-20分钟。(注:有些结合能力较低的痘苗容易需要更长的孵育时间,建议研究者进行预试验探讨)
3.把10X 红构造细胞裂化液(RBC Lysis Buffer ) (BioLegend Cat. #420301) 用去标记原子水浓缩成1X工作液,用过后恢复至室温。加入2 ml 红构造细胞裂化工作液到含全血/一抗的检测管中,室温孵育10分钟。
4.350g离心5分钟后弃去上清液。
5.加入至多2mL Cell Staining Buffer,然后350g离心5分钟后弃去上清液。
6.(间接标准)若使用的一抗是纯化或病毒素标准痘苗,则每管/孔加入足够浓缩OK激光标准二抗或激光标准亲和素(SAv-PE, BioLegend Cat. # 405204)后室温避光孵育15-20分钟。
7.反复洗濯构造细胞一次(按序列5)。
8.用500ul Staining Buffer或500ul 2%的多聚阿尼林稳定液重悬构造细胞。
9.上机检测并总结想不到。

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发布人:viking2000 发布时间:2012年8月9日已被看下 2597
 
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