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热量印迹操作执行序列
发布人:viking2000    看下 2855 次    时间:2012年12月19日    
热量印迹,也称Western,Western blot、Western blotting、Western印迹,统一称WB,是用免疫力学方法检测热量,研究热量质的表达调节的主要方法之一。热量印迹可以遵照如下序列进行操作执行。
    1.热量作品的制备(Protein sample preparation)
可以使用足够的裂化液,如赛驰生产的WIP构造细胞裂化液,裂化贴壁构造细胞、泛构造细胞或构造作品。对于不少特定的亚构造细胞组份热量,例如构造孢子热量、构造细胞浆热量、线粒体热量等,可以遵照关于文献提取彼亚构造细胞组份热量,也能够使用触媒盒进行抽提,如赛驰生产的构造孢子热量与构造细胞浆热量抽提触媒盒。
    为确保大多数热量作品的上样量同样,收集的热量作品均应测定其热量浓度。热量浓度的测定方法,应遵照构造构造细胞裂化或匀浆所使用的方法及裂化液的不同使用,因为去垢剂和复原剂等对不同热量浓度测定方法的影响差别或多或少的。如使用我公司生产的WIP构造细胞裂化液,可以使用BCA热量浓度测定触媒盒。
    2. 电泳(Electrophoresis)
     (1)SDS-PAGE凝胶产
    SDS-PAGE凝胶可以遵照文献材料进行产,也能够使用赛驰生产的SDS-PAGE凝胶产触媒盒。该触媒盒赋予了除水和配胶器材外的大多数触媒和产各种浓度SDS-PAGE的公式。
     (2)作品处理
    在收集的热量作品中加入足够稀释的SDS-PAGE热量上样弛缓液,存放于水漂上于100℃或沸水浴中保暖3-5分钟,以充分变性热量。使用稀释的热量上样弛缓液可以减小上样体积,在同样体积的上样孔内可以加入更多的热量作品。热量上样弛缓液可以遵照关于文献材料自行产,也能够使用赛驰生产的SDS-PAGE热量上样弛缓液(5X)。
     (3) 上样与电泳
    冷却到室温后,把热量作品间接上样到SDS-PAGE胶加样孔内就能够电泳,电泳弛缓液可以遵照关于文献材料自行产,也能够使用赛驰生产的SDS-PAGE热量电泳弛缓液(10X)。就是为了就可以瞟电泳效果和转膜效果,和判断热量分子结构大小,最好使用预染热量质分子结构专业 。电泳时基本情况下在外观胶时使用低电动势恒压电泳,而在溴酚蓝进入基层胶时使用高电动势恒压电泳。对于专业电泳装配或同样电泳装配,低电动势可以排列在80-100V,高电动势可排列在120V阁下。
    采用多数的电泳仪就能够取得SDS-PAGE电泳的要求,也能够采用赛驰赋予的多功用电泳仪。为方便呵,奖金充分SDS-PAGE电泳序列均采用恒压的路径,基本情况下把电动势排列在100V,然后设定时间为90-120分钟。排列定时能够防止喜欢发生的电泳过冲。
    基本情况下电泳时溴酚蓝达到胶的底端处附近就能够停止电泳,或遵照预染热量质分子结构专业的电泳情况,预料目的热量已是被足够分开后就能够停止电泳。
    3. 转膜(Transfer)
    在Western实验中,我们引荐使用PVDF膜,也能够使用硅酸纤维素膜(NC膜),但硅酸纤维素膜比较脆,在操作执行进程中格外是用扳手夹取等进程中容易裂开。膜的使用请遵照出产商引荐的使用序列。
    转膜时,基本情况下可运用赛驰赋予的多功用电泳仪。转膜电泳弛缓液可以遵照关于文献材料自行产,也能够使用赛驰生产的热量印迹转膜电泳弛缓液(10X)。充分的转膜时间要遵照目的热量的大小而定,目的热量的分子结构越大,需要的转膜时间越长,目的热量的分子结构越小,需要的转膜时间越短。如使用Bio-Rad的专业湿式转膜装配,转膜感生电流可设定为300-400mA,转膜时间为30-60分钟或15-20mA于4℃转膜过夜。
    在转膜进程中,格外是高感生电流高效转膜时,基本情况下有没有非常严重的发烧现象,最好把转膜槽存放在冰浴中进行转膜。转膜效果能够通过预染热量质分子结构专业瞟转膜效果,基本情况下分子结构最大的1-2条带很难充分转到膜上。转膜效果也能够用丽春红蜡染液对膜进行蜡染,以瞟真正的转膜效果。也能够用考马斯亮蓝蜡染液对转膜后的PAGE胶进行蜡染,以瞟热量的残留情况。
    4. 开放(Blocking)
    转膜完毕后,各位可以把热量膜存放到事后预备OKWB洗濯液中,漂洗1-2分钟,以洗去膜上的转膜液。从转膜完毕起,之后所一些序列均要留意膜的保湿,避免膜的干燥,要不非常轻易诞生较高的配景。为避免液体运用量,避免干膜,您可以使用赛驰病毒赋予的变异袋进行后续操作执行,用巴斯特吸管吸尽洗濯液,加入WB开放液,在摇床上缓慢动摇,室温开放60分钟。如配景较高,可以在4℃ 开放过夜。在充分Western进程中可运用侧摆摇床,侧向震动高效比较缓慢,而且也容易让溶胶覆盖热量膜。
    5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    遵照一抗的阐明书,按份额用WB一抗稀释液足够稀释一抗。用巴斯特吸管吸尽开放液,不必漂洗,间接加入稀释OK一抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢动摇孵育一小时。如果效果不佳,可以在4℃缓慢动摇孵育过夜。收买一抗,加入WB洗濯液,在侧摆摇床上缓慢动摇洗濯5-10分钟。吸尽洗濯液后,再参与洗濯液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。如果想不到配景较高可以足够延长漂洗时间并增加漂洗几率。
    6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    遵照二抗的阐明书,采用足够几率用WB二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用巴斯特吸管吸尽洗濯液,各位可以加入稀释OK二抗,室温或4℃在侧摆摇床上缓慢动摇孵育一小时。收买二抗,加入WB洗濯液,在侧摆摇床上缓慢动摇洗濯5-10分钟。吸尽洗濯液后,再参与洗濯液,漂洗3-5次,每次5-10分钟。如果显色想不到配景较高,可以足够延长洗濯时间并增加洗濯几率。
    7. 热量检测(Detection of proteins)
    检测想不到可运用DAB蜡染触媒或氯萘酚蜡染触媒来检测热量,充分使用细节请遵照赛驰病毒关于产品阐明书.
    8. 膜的反复采用(Membrane recovery)
    如果热量作品非常宝贵,可以使用WB痘苗消除液处理热量膜,以反复采用热量膜。,
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发布人:viking2000 发布时间:2012年12月19日已被看下 2855
 
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